Acta Haematologica Polonica, 2006, 37, 3
MARTA ZUBKOWICZ · BARBARA CEBULA · ANNA LINKE · AGNIESZKA JANUS · TADEUSZ ROBAK · PIOTR SMOLEWSKI
Cytotoksyczne działanie rapamycyny, inhibitora kinazy mTOR, stosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z bortezomibem, inhibitorem proteasomu, na komórki szpiczaka mnogiego in vitro
Cytotoxic activity of rapamycin, the mTOR kinase inhibitor, used alone or in combination with bortezomib, proteasome inhibitor, on multiple myeloma cells in vitro
- SłOWA KLUCZOWE:
- Szpiczak mnogi • Bortezomib • Proteasom • Rapamycyna • Kinaza mTOR • Komórki RPMI 8226
- KEY WORDS:
- Multiple myeloma • Bortezomib • Proteasome • Rapamycin • mTOR kinase • RPMI 8226 cells
STRESZCZENIE: W ostatnich latach do terapii chorób nowotworowych, w tym szpiczaka mnogiego (multiple myeloma, MM), wprowadzono koncepcję leczenia biologicznego, skierowanego na ważne mechanizmy regulacyjne, decydujące o przeżyciu lub śmierci komórki guza. Jednym z przedstawicieli tej grupy leków jest specyficzny inhibitor proteasomu, bortezomib (BOR), ostatnio coraz częściej testowany w MM w skojarzeniach z innymi lekami przeciwnowotworowymi. Z drugiej strony, bardzo obiecujące wydaje się hamowanie kluczowego dla wzrostu i proliferacji komórki szlaku kinazy mTOR. Do inhibitorów mTOR należy rapamycyna (RAPA), która nie była dotąd stosowana w MM.
Przedmiotem pracy była ocena efektu cytotoksycznego RAPA, stosowanej osobno oraz w skojarzeniu z BOR, na komórki linii szpiczakowej RPMI 8226 in vitro. W 24-godzinnych hodowlach komórki te inkubowano z różnymi stężeniami RAPA i BOR. Badano efekt cytotoksyczny leków (odsetek komórek dodatnich w barwieniu z jodkiem propydyny; JP+), ich wpływ na indukcję apoptozy oraz na cykl komórkowy. Określano także ekspresję białek związanych z kinazą mTOR [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1), 4E-BP1] oraz wybranych białek regulujących proces apoptozy z rodziny Bcl-2 (Bcl-2 i Bax) oraz p53 (p53 i p73).
Cytotoksyczny efekt RAPA i BOR na komórki MM in vitro był zależny od dawki. Obydwa leki znamiennie indukowały apoptozę komórek RPMI 8226. Wykazano wysoki stopień korelacji pomiędzy odsetkiem komórek JP+ a odsetkiem komórek apoptotycznych (frakcja subG1) (R=0,87 dla RAPA, R=0.92 dla BOR; dla obydwu leków p<0.001). W przypadku RAPA obserwowano także zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G1, z zablokowaniem progresji do fazy S i G2M. Połączenie 1nM BOR z 100nM RAPA powo-dowało statystycznie znamienny wzrost cytotoksyczności w porównaniu do leków stosowanych osobno (p < 0.05). Efekt ten w głównej mierze polegał na zahamowaniu ekspresji czynnika transkrypcyjnego 4E-BP1 (p<0.031 w stosunku do kontroli). Ponadto, zarówno BOR jak i RAPA zwiększały ekspresję białek p73 oraz p53, jednak kombinacja tych leków nie zwiększała dalej tego efektu. Nie stwierdzono statystycznie istotnych zmian w ekspresji białek z rodziny Bcl-2 pod wpływem skojarzonego działania RAPA i BOR.
Wyniki te wskazują na znamienną cytotoksyczność łącznego stosowania RAPA i BOR na szpiczakowe komórki RPMI 8226. Potencjalna korzyść ze skojarzonego stosowania RAPA i BOR w MM wymagała jednak potwierdzenia w dalszych badaniach.
Przedmiotem pracy była ocena efektu cytotoksycznego RAPA, stosowanej osobno oraz w skojarzeniu z BOR, na komórki linii szpiczakowej RPMI 8226 in vitro. W 24-godzinnych hodowlach komórki te inkubowano z różnymi stężeniami RAPA i BOR. Badano efekt cytotoksyczny leków (odsetek komórek dodatnich w barwieniu z jodkiem propydyny; JP+), ich wpływ na indukcję apoptozy oraz na cykl komórkowy. Określano także ekspresję białek związanych z kinazą mTOR [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1), 4E-BP1] oraz wybranych białek regulujących proces apoptozy z rodziny Bcl-2 (Bcl-2 i Bax) oraz p53 (p53 i p73).
Cytotoksyczny efekt RAPA i BOR na komórki MM in vitro był zależny od dawki. Obydwa leki znamiennie indukowały apoptozę komórek RPMI 8226. Wykazano wysoki stopień korelacji pomiędzy odsetkiem komórek JP+ a odsetkiem komórek apoptotycznych (frakcja subG1) (R=0,87 dla RAPA, R=0.92 dla BOR; dla obydwu leków p<0.001). W przypadku RAPA obserwowano także zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G1, z zablokowaniem progresji do fazy S i G2M. Połączenie 1nM BOR z 100nM RAPA powo-dowało statystycznie znamienny wzrost cytotoksyczności w porównaniu do leków stosowanych osobno (p < 0.05). Efekt ten w głównej mierze polegał na zahamowaniu ekspresji czynnika transkrypcyjnego 4E-BP1 (p<0.031 w stosunku do kontroli). Ponadto, zarówno BOR jak i RAPA zwiększały ekspresję białek p73 oraz p53, jednak kombinacja tych leków nie zwiększała dalej tego efektu. Nie stwierdzono statystycznie istotnych zmian w ekspresji białek z rodziny Bcl-2 pod wpływem skojarzonego działania RAPA i BOR.
Wyniki te wskazują na znamienną cytotoksyczność łącznego stosowania RAPA i BOR na szpiczakowe komórki RPMI 8226. Potencjalna korzyść ze skojarzonego stosowania RAPA i BOR w MM wymagała jednak potwierdzenia w dalszych badaniach.
SUMMARY: In the recent years the concept of biological, targeted treatment of malignancies has been introduced. Among the biological drugs a specific proteasome inhibitor - bortezomib (BOR), has been found to be very active in multiple myeloma (MM). It is now being often tested in MM for combinations with other drugs. Targeting the mTOR kinase pathway, important for the cell growth and proliferation, is another very promising anti-tumor approach. One of the mTOR inhibitors is rapamycin (RAPA), which has not been used in MM so far.
We investigated cytoxic effect of RAPA alone or in combination with BOR on MM-derived RPMI 8226 cell line in vitro. Cells were treated for 24 hours with different concentrations of RAPA and BOR. Cytotoxicity (percentage of cells positive in propydium iodide staining; PI+ cells), apoptosis (hypoploid, subG1 fraction in a DNA content histogram) and cell cycle were assessed. Additionally, we measured expression of several proteins associated with the Akt-mTOR kinase pathway [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1), 4E-BP1] as well as apoptosis-regulating proteins from Bcl-2 and p53 families (Bcl-2, Bax, p53 and p73).
Cytotoxic effect of RAPA and BOR in vitro was dose-dependent. Both drugs significantly induced apoptosis of RPMI 8226 cells. There was a high correlation between the rate of PI+ and apoptotic cells (R=0,87for RAPA and R=0.92 for BOR; both p<0.001). RAPA arrested RPMI 8226 cells in G1 phase of the cell cycle and inhibited progression to S and G2M phases. Combination of 1nM of BOR and 100nM of RAPA induced significant increase in cell cytotoxicity compared to those drugs used alone (p<0.05). The combination inhibited expression of transcription factor 4E-BP1 (p<0.031 vs control). Moreover, both RAPA and BOR increased expression of p53 and p73, however their combined use did not further enhance this effect. We did not observe any significant changes in Bcl-2 family protein expression in response to RAPA+BOR combination.
In conclusion, the results indicate a significant toxicity of combined treatment of RAPA and BOR on MM-derived cells. This finding needs confirmation in further studies.
We investigated cytoxic effect of RAPA alone or in combination with BOR on MM-derived RPMI 8226 cell line in vitro. Cells were treated for 24 hours with different concentrations of RAPA and BOR. Cytotoxicity (percentage of cells positive in propydium iodide staining; PI+ cells), apoptosis (hypoploid, subG1 fraction in a DNA content histogram) and cell cycle were assessed. Additionally, we measured expression of several proteins associated with the Akt-mTOR kinase pathway [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1), 4E-BP1] as well as apoptosis-regulating proteins from Bcl-2 and p53 families (Bcl-2, Bax, p53 and p73).
Cytotoxic effect of RAPA and BOR in vitro was dose-dependent. Both drugs significantly induced apoptosis of RPMI 8226 cells. There was a high correlation between the rate of PI+ and apoptotic cells (R=0,87for RAPA and R=0.92 for BOR; both p<0.001). RAPA arrested RPMI 8226 cells in G1 phase of the cell cycle and inhibited progression to S and G2M phases. Combination of 1nM of BOR and 100nM of RAPA induced significant increase in cell cytotoxicity compared to those drugs used alone (p<0.05). The combination inhibited expression of transcription factor 4E-BP1 (p<0.031 vs control). Moreover, both RAPA and BOR increased expression of p53 and p73, however their combined use did not further enhance this effect. We did not observe any significant changes in Bcl-2 family protein expression in response to RAPA+BOR combination.
In conclusion, the results indicate a significant toxicity of combined treatment of RAPA and BOR on MM-derived cells. This finding needs confirmation in further studies.
