STRESZCZENIE: Kluczową rolę w zahamowaniu apoptozy komórek przewlekłej białaczki B-komórkowej (B- PBL) przypisuje się kaskadzie kinazy fosfatydyloinozytolu 3 (PI3K). Jej konstytutywną aktywację, prowadzącą m.in. do inaktywacji białek proapoptotycznych, obserwuje się limfocytach B- PBL, zaś zahamowanie jej aktywności powoduje apoptozę tych komórek. Pomimo udowodnionego udziału kaskady PI3K w przeżyciu limfocytów B-PBL, nie opublikowano dotychczas prac nad wpływem aktywacji tej kinazy na obraz kliniczny choroby. Nie jest też jasne znaczenie ekspresji czynnika stymulującego limfocyty B (B-lymphocyte stimulator, B-LyS) obserwowanej przez niektórych autorów na limfocytach B-PBL. Celem niniejszych badań była ocena ekspresji powierzchniowej B-LyS oraz indukowanej przez inhibitor PI3K (LY294002) apoptozy limfocytów krwi obwodowej uzyskanych od 81 uprzednio nie leczonych chorych na B-PBL w różnych stadiach zaawansowania klinicznego. Apoptozę indukowaną przez LY294002 oceniano obliczając różnicę pomiędzy określonym cytofluorometrycznie odsetkiem komórek barwiących się aneksyną V po 24-godzinnej hodowli w obecności tego czynnika oraz po 24-godzinnej hodowli bez LY294002 (różnica pomiędzy apoptozą zachodzącą w obecności LY294002 oraz apoptozą spontaniczną). Apoptozę indukowaną przez LY294002 określono również w limfocytach krwi obwodowej 13 zdrowych osób w porównywalnym wieku (grupa porównawcza). Podczas czasu obserwacji trwającego średnio 19,6 mies. u 30 pacjentów doszło do progresji choroby wymagającej rozpoczęcia leczenia cytostatycznego. Apoptoza indukowana LY294002 była istotnie wyż- sza zarówno w limfocytach B-PBL w porównaniu z limfocytami T osób zdrowych (20,4% ± 12,5 vs 1,9% ± 1,6), jak również u pacjentów wykazujących progresję białaczki w porównaniu z chorymi nie wymagającymi leczenia (27,7% ± 11,8 vs 16,1% ± 11,0), oraz u chorych wykazujących ekspresję antygenu CD38 lub ZAP-70 na co najmniej 20% limfocytów (CD38+, ZAP-70+) w stosunku do pacjentów odpowiednio CD38- i ZAP-70- (29,3% ± 15,4 vs 17,1% ± 11,6 dla CD38 i 26,0 ± 13,5 vs 15,9 ± 11,7 dla ZAP-70). Nie wykazano związku pomiędzy apoptozą indukowaną LY294002 a stadium klinicznym Rai ani liczbą limfocytów krwi obwodowej. Na limfocytach żadnego z badanych pacjentów nie wykazano ekspresji B-LyS. Powyższe obserwacje wskazują na możliwość udziału szlaku PI3K w dynamice klinicznej B-PBL, oraz sugerują celowość badań nad związkiem pomiędzy aktywnością tego szlaku antyapoptotycznego w komórkach B-PBL a ekspresją na ich powierzchni antygenu CD38 i ZAP-70.

SUMMARY: Constitutive activation of phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) is thought to play a crucial role in the downregulation of apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells. The activity of PI3K leads to the inactivation of several proapoptotic proteins and the inhibition of this kinase results in the cell death. Despite a well documented role played by PI3K cascade for the survival of B-CLL lymphocytes, it is unclear to what extent its activation influences the clinical picture of the disease. It is also unknown what is the biological and clinical significance of the expression of B-LyS (B-lymphocyte stimulator) stated by some investigators on B-CLL cells. We therefore undertook a study on the surface B-LyS expression and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY294002-induced apoptosis of leukemia cells of 81 previously untreated patients with B-CLL. LY294002-induced apoptosis was calculated using a flow cytometry method as a difference between the percentage of annexin V- staining cells after 24-hours culture in the medium containing LY294002 (LY294002-enhanced apoptosis) and in the medium without this factor (spontaneous apoptosis). LY294002-induced apoptosis was also calculated for peripheral blood T lymphocytes obtained from 13 healthy subjects. During the follow-up period of an average 19.6 months the cytostatic treatment had to be started in 30 patients. LY294002-induced apoptosis was significantly higher in B-CLL cells than in normal lymphocytes (20.4% ± 12.5 vs 1.9% ± 1.6). LY294002-induced apoptosis was also significantly higher in B-CLL patients with progressive disease as compared to patients who did not need treatment (27.7% ± 11.8 vs 16.1% ± 11.0), as well as in patients CD38- or ZAP-70-positive (i.e. with CD38 or ZAP-70 expression on > 20% leukemic lymphocytes) than in patients CD38- and ZAP-70-negative (respective number being: 29.3% ± 15.4 vs 17.1% ± 11.6 for CD38 and 26.0 ± 13.5 vs 15.9 ± 11.7 for ZAP-70). We did not find any relationship between LY294002-induced apoptosis and clinical stage according to Rai classification nor peripheral blood lymphocytosis. Surface B-LyS expression was detected in none of the B-CLL lymphocyte populations studied. Our findings suggest a possibility of the involvement of PI3K cascade in the clinical progression of B-CLL patients, and point out to the necessity of further studies on a possible relationship between the PI3K signaling pathway and CD38 as well as ZAP-70 expression in B-CLL cells.